Nouvelles colonnes échangeuses d’anions 4 µm

Thermo Scientific étend sa gamme de colonnes pour l’analyse des oligonucléotides. Il s’agit des colonnes DNAPac PA200 RS. Disponibles en 3 dimensions (50 x 4.6 mm, 150 x 4.6 mm et 250 x 4.6 mm), ces colonnes bénéficient d’une technologie à faible diamètre de particules (4 µm) et à forte résistance mécanique (elles peuvent supporter des pressions allant jusqu’à 750 bars/11 000 psi). Ces phases échangeuses d’anions utilisent la même chimie que les DNAPac PA200 existantes dont les particules ont un diamètre de 8 µm.

De manière tout à fait attendue, plusieurs exemples présentés mettent en évidence un gain d’efficacité sur la colonne RS (4 µm) par rapport à l’ancien support (8 µm) en particulier sur les oligonucléotides.

Par contre, le gain de résolution évoqué, n’est pas très évident sur les chromatogrammes présentés, notamment sur la séparation de 7 anions où la concentration injectée semble plus importante sur la colonne 8 µm ce qui, bien sur, peut dégrader la résolution observée.

Thermo1

En effet, le transfert à une colonne de plus faible diamètre de particule se traduit généralement par une augmentation de la hauteur de pic et une diminution de la largeur pour une même concentration injectée (à condition que la colonne ai une capacité suffisante).

L’intérêt majeur de ces colonnes échangeuses d’anions réside dans leur résistance à la pression (750 b) ce qui ouvre le champ d’utilisation aux systèmes UHPLC.

Source : J.R. Thayer et al., Performance Improvements for High Resolution Anion-Exchange Oligonucleotide Separations Using Small Particle Substrates, Thermo Scientific Poster Note-PN70515_E01/13S

Effet de la pression et de la température sur la séparation d’haloéthanes en SFC (Supercritical Fluid Chromatography)

En SFC, l’état physique du CO2 supercritique, et en particulier sa masse volumique, a une influence sur sa polarité et donc sur la rétention des composés [1].

Pour moduler cette polarité, il convient de faire varier la pression et/ou la température du fluide. Lorsque la masse volumique décroit (donc que la pression diminue), le facteur de capacité (caractérisant la rétention) augmente. Ce phénomène est indépendant de la nature du soluté et de la phase stationnaire, il peut s’expliquer essentiellement par la variation des interactions soluté-phase mobile [2].
Lors d’un précédent post (16 mai 2013), nous avons présenté des résultats obtenus sur la séparation de 2 composés génotoxiques : le 1,2-dibromoéthane et 1-bromo-2-chloroéthane dans des conditions fixes de température (65°C) et de pression (2000 psi).

Pour évaluer l’effet de la pression et de la température sur la séparation de ces composés, nous avons fait varier la pression de sortie du CO2 (de 1500 psi à 3500 psi) en condition isotherme (65°C), puis la température de colonne (de 15°C à 75°C) en condition isobare (2000 psi). L’étude se déroule sur un appareil UPC²™ de Waters®.

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Analyse de filtres solaires par SFC (Supercritical Fluid Chromatography)

Dans la continuité de travaux présentés lors d’une journée AFSEP (4 mars 2010) par Eric Lesellier, nous proposons ici la séparation de six filtres solaires. Ces molécules, très utilisées en cosmétique et dermatologie sont habituellement dosées par des méthodes UHPLC phase inverse. Nous nous intéressons à la possibilité d’une méthode alternative en SFC facilement utilisable en analyse de routine.

Nous avons développé une méthode sur un système UPC2™ (Waters) et une colonne Kinétex C18 – 100 x 4,6 mm de granulométrie 2,6µm (Phenomenex).
Le choix d’une colonne Core-shell  permet de travailler avec des diamètres de particules supérieurs tout en conservant une efficacité comparable aux colonnes sub-2µm.
L’augmentation de la granulométrie diminue la perte de charge dans la colonne et élargit les possibilités d’utilisation d’une quantité importante de co-solvant sans dépasser la limite de pression admissible par le système (450 bars).

Nous avons étudié 4 facteurs : la nature du co-solvant (acétonitrile ou méthanol), le gradient de phase mobile (co-solvant/CO2), le débit de phase mobile et la température de colonne sur la base d’un plan d’expérience définit à partir du logiciel d’optimisation Fusion™ (S-Matrix®). Les réponses étudiées sont le nombre de pics, la symétrie des pics et le temps de rétention du dernier pic.

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Utilisation d’un plan d’expériences pour la mise au point d’analyses par SFC

Nous avons déjà présenté les résultats de travaux en SFC (Supercritical Fluid Chromatography) sur la recherche des substances apparentées du Misoprostol (post du 18 avril 2013). Ces résultats ont été obtenus à partir de plans d’expériences dont la mise en oeuvre est  détaillée dans cet article.

Jacques Goupy1, a beaucoup publié sur cette science de l’organisation des essais qu’il définit ainsi :
« le but de cette nouvelle science est l’optimisation du choix des essais et celui de leur enchaînement au cours de l’expérimentation. (…) ce but peut être atteint à condition que l’expérimentateur se conforme à une méthode rigoureuse et qu’il accepte d’abandonner certaines habitudes. Lorsqu’il aura apprécié la puissance et le bien-fondé de cette nouvelle technique, il en deviendra un adepte fervent et un chaud défenseur. »

Pour générer un plan d’expériences, il convient de définir des facteurs dont on étudiera au moins 2 niveaux (haut et bas). Le nombre et la nature des expériences à réaliser sont déterminés par construction matricielle et dépendent du nombre de facteurs et du nombre de niveaux retenus. Chaque expérience conduit à une ou plusieurs réponses à partir desquelles il est possible d’établir un modèle et donc de calculer les valeurs des facteurs pour lesquelles on obtient la (les) réponse (s) optimale (s).

Dans notre cas, les plans d’expériences sont construits en utilisant le logiciel Fusion™ de S-Matrix® initialement conçu pour la chromatographie liquide (HPLC/UHPLC) et les analyses sont conduites sur un système UPC2™ (Waters®).

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Analyse des tocophérols par SFC (Supercritical Fluid Chromatography)

Nous avons évalué l’intérêt de la Supercritical Fluid Chromatography (SFC) ou Chromatographie en Phase Supercritique (CPS) pour l’analyse des tocophérols.

Photo UPC² de WatersLa SFC est une technique de séparation chromatographique où la phase mobile est un fluide porté à l’état supercritique ou subcritique. On utilise couramment le CO2 car son point critique est facilement accessible (31,0°C et 73,8bars1). La phase stationnaire, contenue dans une colonne, peut être constituée de particules solides de granulométrie fine (silice ou graphite poreux par exemple), ou être chimiquement modifiée comme les phases utilisées en chromatographie liquide.

 

formule générale

Les tocophérols sont des composés largement répandus dans le règne végétal. Cette famille comprend 4 substances : l’α-tocophérol (le plus actif et le plus utilisé), le β-tocophérol, le δ-tocophérol et le γ-tocophérol2.
tableau

Ils sont généralement regroupés sous la terminologie de vitamine E. La vitamine E est le principal anti-oxydant de l’organisme.

 

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