Utilisation d’un plan d’expériences pour la mise au point d’analyses par SFC

Nous avons déjà présenté les résultats de travaux en SFC (Supercritical Fluid Chromatography) sur la recherche des substances apparentées du Misoprostol (post du 18 avril 2013). Ces résultats ont été obtenus à partir de plans d’expériences dont la mise en oeuvre est  détaillée dans cet article.

Jacques Goupy1, a beaucoup publié sur cette science de l’organisation des essais qu’il définit ainsi :
« le but de cette nouvelle science est l’optimisation du choix des essais et celui de leur enchaînement au cours de l’expérimentation. (…) ce but peut être atteint à condition que l’expérimentateur se conforme à une méthode rigoureuse et qu’il accepte d’abandonner certaines habitudes. Lorsqu’il aura apprécié la puissance et le bien-fondé de cette nouvelle technique, il en deviendra un adepte fervent et un chaud défenseur. »

Pour générer un plan d’expériences, il convient de définir des facteurs dont on étudiera au moins 2 niveaux (haut et bas). Le nombre et la nature des expériences à réaliser sont déterminés par construction matricielle et dépendent du nombre de facteurs et du nombre de niveaux retenus. Chaque expérience conduit à une ou plusieurs réponses à partir desquelles il est possible d’établir un modèle et donc de calculer les valeurs des facteurs pour lesquelles on obtient la (les) réponse (s) optimale (s).

Dans notre cas, les plans d’expériences sont construits en utilisant le logiciel Fusion™ de S-Matrix® initialement conçu pour la chromatographie liquide (HPLC/UHPLC) et les analyses sont conduites sur un système UPC2™ (Waters®).

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Un premier plan d’expériences à deux facteurs est réalisé. Les 2 facteurs étudiés sont la colonne et la proportion CO2/co-solvant en fin de gradient. Le type de colonne est une variable discrète pour laquelle nous avons retenu 4 niveaux (Acquity UPC² BEH 1.7µm, 3.0 x 100mm (Waters®), Acquity UPC² BEH-2éthylpyridine 1.7µm, 3.0 x 100mm (Waters®), Acquity UPC² CSH-fluorophényl 1.7µm, 3.0 x 100mm (Waters®) et Acquity UPC² HSS-C18 1.7µm, 3.0 x 100mm (Waters®)). En revanche, la composition du gradient est considérée comme une variable continue pour laquelle nous avons défini un niveau bas (pourcentage méthanol en fin de gradient 5%) et un niveau haut (20%).

Le logiciel a ainsi généré un plan comprenant 20 expériences. Chaque expérience consiste à injecter le mélange des composés pour des valeurs particulières des facteurs définies dans le plan. Les réponses analysées sont  le nombre de pics, la résolution entre le misoprostol et l’impureté A et la durée de l’analyse.

Figure 1 miso & fusion

Le logiciel modélise les réponses sur l’ensemble du domaine expérimental et permet de calculer les valeurs de chaque facteur conduisant à la meilleure solution répondant aux critères suivant:
Avoir 5 pics (2 pics isomères du misoprostol et 3 impuretés : A, C et D), avoir une résolution maximale entre le pic 2 du misoprostol et l’impureté A et avoir un temps d’analyse le plus court possible.

Le chromatogramme obtenu dans les conditions optimales (Facteur 1 = BEH-diethylpyridine et Facteur 2 = 10%) est en bon accord avec les prévisions du modèle : une résolution de 8.5 entre le pic 2 du misoprostol et l’impureté A (versus 9.5 selon modèle) et un temps de rétention du dernier pic de 4.2 min (versus 4.2 selon modèle).

Un second plan d’expériences est réalisé afin de de raccourcir le temps d’analyse sans altérer la résolution.
Cette fois les facteurs étudiés sont la proportion de méthanol en début de gradient (niveau bas 0% – niveau haut 9.5%) et la température de la colonne (35 – 60°C), le plan comporte 17 expériences.

Figure 2 miso & fusionLà encore, les réponses obtenues sont analysées et modélisées. La figure ci-contre est une représentation en 3D de la surface de réponse (résolution) en fonction de la température de la colonne et du pourcentage initial de méthanol dans la phase mobile. Pour obtenir la meilleure résolution, il faut donc se placer dans la zone rouge.

La Figure ci-dessous est une autre représentation que permet le logiciel Fusion™.Figure 3 miso & fusion Ce graphique représente un découpage de la zone expérimentale en fonction de valeurs cibles définies par l’expérimentateur. La zone blanche représente la partie du domaine expérimental dans laquelle toutes les valeurs cible sont atteintes ou dépassées simultanément. Les points A, B, C et D sont les expériences à réaliser pour évaluer la robustesse de la méthode optimale (T).

 

 

Figure 4 miso & fusionL’expérience T est réalisée. La résolution entre les pics est conservée avec un temps d’analyse plus court puisque tous les pics sont élués en moins de 3 minutes.

 

 

Logo S-Matrix

Il est donc possible d’utiliser le logiciel Fusion™ pour développer rapidement une méthode d’analyse en chromatographie en fluide supercritique. La mise en oeuvre d’un plan d’expériences selon une  démarche cohérente et structurée contribue fortement à la qualité du résultat obtenu et à la facilité de son transfert vers un laboratoire tiers.

1 : Jacques Goupy, Plans d’expérience, P230-1, Techniques de l’Ingénieur, Edition T. I.

 

2 réflexions au sujet de « Utilisation d’un plan d’expériences pour la mise au point d’analyses par SFC »

  1. Bonjour. Bel exemple d’utilisation de DOE pour le développement de méthodes. Il me semblerait intéressant d’ajouter la variable nature du solvant organique (variable discrète), qui est important en SFC. Ca ne devrait pas compliquer l’analyse statistique des résultats (3 critères étudiés soit dans les recommendations du logiciel) tout en ayant une chance d’obtenir une meilleure résolution sur les 2 isomères du misoprostol.

    • Merci Stéphane pour ce commentaire. Pour cette première problématique, nous n’avions pas étudié d’autre co-solvant que le méthanol mais c’est vrai qu’il serait intéressant de regarder ce que cela modifierait sur la résolution. Dans les plans d’expériences qui ont suivi, j’ai incorporé cette variable.

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