Les colonnes HPLC à noyaux durs peuvent-elles vraiment rivaliser avec les performances de l’UHPLC ?

En première intention, nous utilisons systématiquement l’UHPLC pour développer les méthodes de séparation en chromatographie liquide. Cependant, nous sommes régulièrement obligés de transférer ces méthodes en conditions HPLC pour les adapter à l’équipement disponible chez nos clients. A cette occasion, le choix de la colonne et les performances associées alimentent les discussions techniques et aboutissent immanquablement à la questions suivante:
Jusqu’où les colonnes modernes (noyaux durs en particulier) utilisables à moins de 450-500bars peuvent rivaliser avec les performances de l’UHPLC ?
Pour apporter des éléments de réponse, nous avons comparé 8 colonnes (1 UHPLC et 7 HPLC) lors de la mise au point d’une méthode d’analyse de 2 principes actifs pharmaceutiques et de leurs 4 impuretés. Ils nous a semblé intéressant d’analyser ces résultats hors du contexte de l’étude afin d’apporter des éléments comparatifs entre les différentes colonnes testées.

Description des 8 colonnes

photo tableau

La méthode développée a été déclinée sur chaque colonne en tenant compte des paramètres géométriques. La quantité injectée, la programmation du gradient et le débit ont donc été adaptés.

chromatoPour évaluer la performance de chaque colonne, nous avons retenu   4 critères : la moyenne des 6 facteurs de symétrie, la moyenne des largeurs à la base des 6 pics, la moyenne des 5 résolutions et la moyenne des 6 nombres de plateaux théoriques par unité de longueur. Nous avons ensuite utilisé une fonction de désirabilité (Derringer et Suich) pour trouver le meilleur compromis sur ces 4 paramètres.

tableau desirab

Dans notre cas nous avons choisi pour chaque critère une fonction linéaire variant entre les bornes 0 (valeur la plus petite de la collection pour le critère considéré) et 1 (valeur la plus grande de la collection pour le critère considéré).

graph

 

On obtient ainsi pour chaque colonne 4 valeurs de désirabilité correspondant aux 4 critères retenus.

 

 

desirabilite

Le score d’une colonne est obtenu en calculant la désirabilité globale comme la moyenne géométrique des désirabilités individuelles de chaque critère pour la colonne considérée.

graph global

Les valeurs des désirabilités des quatre critères étudiés sont homogènes sur les 5 premières colonnes. Cette homogénéité n’est plus observée sur les trois autres colonnes dont la désirabilité globale est inférieure à 0,5. On peut noter une très bonne performance des colonnes à noyau dur. Les trois colonnes de trois marques différentes ont des résultats très proches avec des désirabilités globales supérieures à 0,8 et comparables à celle obtenue sur la colonne UHPLC (Acquity CSH C18).

Ces résultats ont été obtenus pour une méthode d’analyse et une série de composés particuliers, il serait donc hasardeux de trop généraliser ces conclusions. Néanmoins cet exemple montre que les colonnes à noyau dur peuvent être une alternative aux méthodes UHPLC pour les laboratoires qui ne possèdent pas l’équipement et qui n’ont pas de contraintes fortes sur la durée d’analyse.

 

 

En SFC : Colonnes poreuses ou noyau dur ?

De la même manière que nous nous étions intéressés à cette comparaison en UHPLC, nous présentons ici des résultats d’analyse de 4 acides gras saturés par SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry) obtenus sur cinq colonnes.

Le mélange d’acides gras est composé des acides laurique C12:0, myristique C14:0, palmitique C16:0 et stéarique C18:0.
Les colonnes testées sont indifféremment utilisables en chromatographie liquide ou supercritique:

  • Colonnes à particules poreuses
    Aquity HSS C18 100 x 3 mm – 1,8 µm (Waters)
    ACE Excel 2 super C18 100 x 3 mm – 2 µm (AIT)
    XBridge 100 x 3 mm – 3,5 µm (Waters)
  • Colonnes à noyaux durs
    Kinetex C18 100 x 3 mm – 2,6 µm (Phenomenex)
    Nucleoshell RP18 100 x 3 mm – 2,7 µm (Macherey-Nagel)

Nous avons utilisé un système chromatographique UPC2™ (Waters) couplé à une détection masse (quadripôle avec source electro-spray). Pour chaque colonne, le débit et le gradient ont été adaptés à la granulométrie pour maintenir les conditions optimales de vitesse linéaire de la phase mobile.

chromatos

tableau

Comme attendu, les performances des colonnes poreuses s’améliorent avec la diminution de la granulométrie.
Par contre, il est plus étonnant  de constater que l’efficacité des 2 colonnes noyaux durs testées reste en deçà de celle des poreuses sub 2 µm et simplement comparable à celle d’une phase poreuse 3.5 µm (XBridge).

Nous n’avions pas observé cela jusqu’à présent en UHPLC. Le coefficient de diffusivité élevé du COà l’état supercritique est un des facteurs majeur expliquant les performances des colonnes sub 2µm dans cette expérience, il favorise le processus de transfert de masse entre les deux phases et a donc tendance à niveler cet avantage connu des colonnes core-shell.

Intérêt de la SFC pour l’analyse de composés aromatiques halogénés

Nous avons évalué l’intérêt d’une méthode SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry) pour la recherche de composés aromatiques halogénés, impuretés d’un intermédiaire de synthèse d’un principe actif pharmaceutique.

La SFC est une technique de séparation chromatographique où la phase mobile est un fluide porté à l’état supercritique ou subcritique. On utilise couramment le CO2 car son point critique est facilement accessible (31,0°C et 73,8 bars). La phase stationnaire, contenue dans une colonne, peut être constituée de particules solides de granulométrie fine (silice ou graphite poreux par exemple), ou être chimiquement modifiée comme les phases utilisées en chromatographie liquide.

Nous avons développé une méthode sur un système UPC2™ (Waters) couplé à une détection masse (quadripole avec source electrospray).
4 facteurs ont été étudiés : la nature du co-solvant (acétonitrile, méthanol éthanol), le gradient de phase mobile (co-solvant/CO2), la température de colonne et la nature de la colonne (Éthyle pyridine, C18, silice, fluorophenyl) sur la base de trois plans d’expériences définit à partir du logiciel d’optimisation Fusion™ (S-Matrix®). Les réponses étudiées sont le nombre de pics, la résolutions des pics et le temps de rétention du dernier pic.
Lire la suite

Pics parasites en chromatographie liquide

Citation

Dans le dernier  LC/GC Europe (volmue 26 – numéro 8 – août 2013), John W. Dolan publie un article sur les pics fantômes en HPLC et passe en revue plusieurs sources potentielles de pics parasites dans les gradients d’élution.

Fig 1

L’eau et les tampons de la phase mobile sont décrits comme les vecteurs principaux de la contamination. Les traces de contaminants se concentrent sur la colonne puis sont élués lors de la montée du gradient.
Pour confirmer cette hypothèse, l’auteur présente deux chromatogrammes correspondant à l’injection d’un blanc après des temps d’équilibration de 10 et 30 minutes. Il apparaît clairement que la concentration en contaminant augmente avec le temps d’équilibration.

Lire la suite

Colonnes sub 2 µm: poreuse ou core-shell ! (suite)

  

Comme suite à l’article du 13 juin 2012 dans lequel nous avions présenté les résultats de la comparaison d’une colonne core-shell Kinetex™ PFP 100 x 2.1 mm 1.7 µm (Phenomenex), et d’une colonne poreuse Acquity™ PFP 100 x 2.1 mm 1.8 µm (Waters) pour l’analyse UHPLC d’un échantillon d’oligosaccharide thérapeutique (C95H143N11O59S8Na8 – Mw = 2823 g/mol), nous avons étendu le test à 3 autres colonnes poreuses:

- Pinnacle™ PFP Propyl 100 x 2.1 mm 1.7 µm (Restek)
- Hypersil Gold™ PFP 100 x 2.1 mm 1.9 µm (Thermo)
- ACE Excel 2™ C18-PFP 100 x 2.1 mm 2.0 µm (AIT)

Les conditions d’analyses sont identiques pour toutes les colonnes, détection UV 244 nm, gradient d‘élution Méthanol/Tampon de 10 min.