En première intention, nous utilisons systématiquement l’UHPLC pour développer les méthodes de séparation en chromatographie liquide. Cependant, nous sommes régulièrement obligés de transférer ces méthodes en conditions HPLC pour les adapter à l’équipement disponible chez nos clients. A cette occasion, le choix de la colonne et les performances associées alimentent les discussions techniques et aboutissent immanquablement à la questions suivante:
Jusqu’où les colonnes modernes (noyaux durs en particulier) utilisables à moins de 450-500bars peuvent rivaliser avec les performances de l’UHPLC ?
Pour apporter des éléments de réponse, nous avons comparé 8 colonnes (1 UHPLC et 7 HPLC) lors de la mise au point d’une méthode d’analyse de 2 principes actifs pharmaceutiques et de leurs 4 impuretés. Ils nous a semblé intéressant d’analyser ces résultats hors du contexte de l’étude afin d’apporter des éléments comparatifs entre les différentes colonnes testées.
Description des 8 colonnes
La méthode développée a été déclinée sur chaque colonne en tenant compte des paramètres géométriques. La quantité injectée, la programmation du gradient et le débit ont donc été adaptés.
Pour évaluer la performance de chaque colonne, nous avons retenu 4 critères : la moyenne des 6 facteurs de symétrie, la moyenne des largeurs à la base des 6 pics, la moyenne des 5 résolutions et la moyenne des 6 nombres de plateaux théoriques par unité de longueur. Nous avons ensuite utilisé une fonction de désirabilité (Derringer et Suich) pour trouver le meilleur compromis sur ces 4 paramètres.
Dans notre cas nous avons choisi pour chaque critère une fonction linéaire variant entre les bornes 0 (valeur la plus petite de la collection pour le critère considéré) et 1 (valeur la plus grande de la collection pour le critère considéré).
On obtient ainsi pour chaque colonne 4 valeurs de désirabilité correspondant aux 4 critères retenus.
Le score d’une colonne est obtenu en calculant la désirabilité globale comme la moyenne géométrique des désirabilités individuelles de chaque critère pour la colonne considérée.
Les valeurs des désirabilités des quatre critères étudiés sont homogènes sur les 5 premières colonnes. Cette homogénéité n’est plus observée sur les trois autres colonnes dont la désirabilité globale est inférieure à 0,5. On peut noter une très bonne performance des colonnes à noyau dur. Les trois colonnes de trois marques différentes ont des résultats très proches avec des désirabilités globales supérieures à 0,8 et comparables à celle obtenue sur la colonne UHPLC (Acquity CSH C18).
Ces résultats ont été obtenus pour une méthode d’analyse et une série de composés particuliers, il serait donc hasardeux de trop généraliser ces conclusions. Néanmoins cet exemple montre que les colonnes à noyau dur peuvent être une alternative aux méthodes UHPLC pour les laboratoires qui ne possèdent pas l’équipement et qui n’ont pas de contraintes fortes sur la durée d’analyse.
Juste un commentaire sur cet article. Je pense que lorsque l’on compare des colonnes de dimensions différentes (diamètres internes de 2.1, 3 et 4.6mm), le type d’instrument utilisé a aussi une importance capitale. En effet, pour cette étude, vous avez sans doute utilisé un instrument de dernière génération avec des volumes morts très faibles, ce qui est très bien. Ce type de système n’est pas toujours disponible et on a tendance a croire que l’on peut utiliser un peu n’importe quelles dimensions de colonne superficiellement poreuses, sur n’importe quels instruments, du fait de la pression plus raisonnable générée par ces colonnes, ce qui n’est bien sur pas vrai. L’utilisation de colonnes de 2.1mm ou 3 mm sur un système un peu plus ancien peut souvent être décevant, non pas à cause de la technologie de colonne elle-même, mais à cause des contributions de l’instrument à l’élargissement des pics (perte d’efficacité) et la déformation des pics (augmentation de l’asymétrie).
En résumé, les colonnes de 2.1 mm remplies de particules superficiellement poreuses de 2.5-3µm doivent être utilisées sur un système de type UHPLC, alors que les colonnes de 4.6 mm remplies de particules superficiellement poreuses de 2.5-3µm peuvent être utilisées sur un plus grand nombre d’instruments.
Je vous remercie de ce commentaire très pertinent.
Nous avons utilisé le même matériel (UHPLC) pour les 8 colonnes testées. Effectivement la contribution géométrique de l’instrument est importante dans un transfert de méthode UHPLC vers HPLC et conditionne le choix des dimensions de la colonne. C’est un paramètre que nous prenons systématiquement en compte lors des développements, surtout que le parc matériel de nos clients est très diverse.
Francis PIOLET