Depuis plus de 70 ans, on sait que l’acide ascorbique est présent dans le sang total. Hélas les dosages spectrophotométriques de l’acide ascorbique dans les globules rouges 
sont difficiles à cause de multiples interférences. Or les enjeux de disposer d’une méthode de dosage fiable sont nombreux. Outre ses propriétés anti-oxydantes, cette molécule est soupçonnée d’être la cause d’accidents de transfusion. Ces accidents pourraient provenir de défaut de conservation du sang. Afin d’étudier la relation existante entre les lésions constatées sur les globules rouges et la concentration en acide ascorbique dans ces cellules, il était impératif de disposer d’une nouvelle méthode de dosage. Celle-ci devra pallier aux problèmes des anciennes méthodes : faible sensibilité, instabilité de la molécule d’acide ascorbique (oxydée en milieu aqueux), manque de spécificité, interférences avec d’autres composés présents dans le sang total.
Pourquoi l’électrochimie coulométrique ?
La méthode développée par Hongyan Li et al. utilise la technique de l’HPLC couplée à une détection coulométrique. Les échantillons de sang sont recueillis et conservés dans la glace immédiatement après le prélèvement. Après traitement, le plasma ainsi que le culot de globules rouges sont collectés. Les globules sont lysés afin de libérer l’acide ascorbique puis dosés par injection dans le système HPLC.
Bien moins connue et utilisée que la détection spectrophotométrique UV-visible, l’électrochimie couplée à l’HPLC peut être une bonne alternative dans certains cas. Ce mode de détection est très sélectif car, pour déclencher l’électrolyse à l’origine de la détection, il faut appliquer un potentiel qui diffère selon l’ion. Ces détecteurs possèdent également une excellente sensibilité de mesure permettant de doser des traces ainsi qu’une large gamme de mesure. En revanche ces détecteurs sont sensibles au débit d’éluant, au pH et à l’oxygène qui peuvent, selon le potentiel appliqué, perturber la mesure. Il convient donc de fixer précisément un certain nombre de paramètres.
Les détecteurs électrochimiques utilisent les propriétés oxydo-réductrices des solutés, ce qui suppose que la phase mobile soit suffisamment conductrice pour permettre le passage du courant. Les échantillons passant dans la cellule de détection doivent pouvoir s’oxyder ou se réduire à un potentiel suffisamment faible pour ne pas provoquer l’électrolyse de la phase mobile ou des composants de la matrice de l’échantillon. Les détecteurs coulométriques réalisent l’électrolyse totale du soluté.
Dans un détecteur électrochimique, le signal mesuré correspond à la perte ou au gain d’un ou plusieurs électrons : réaction d’oxydo-réduction. Ainsi chaque composé a des conditions particulières d’analyse : pH, potentiel de travail, surface de l’électrode de travail d’où une détection très spécifique.
Résultats
Appliquée ici, cette méthode a permis de détecter une concentration de 26.10-9 mol/L d’acide ascorbique dans des échantillons de sang de seulement 20 µL. De plus, l’ajout d’EDTA (agent chélatant) a permis de stabiliser la molécule qui, sans cela, était oxydée par le fer présent dans les cellules sanguines.
Notre avis…
Pour les molécules possédant des propriétés d’oxydo-réduction, la détection électrochimique peut apparaître comme la solution pour développer des méthodes d’analyse plus sélectives.
La méthode développée par H. Li et al. ouvre de nouvelles perspectives afin de mieux comprendre le rôle de l’acide ascorbique dans les cellules sanguines. L’objectif à terme étant d’établir si l’acide ascorbique est impliqué dans le mécanisme de conservation du sang pour les transfusions.
Source : LI. H. et al., Vitamin C in mouse and human red blood cells : An HPLC assay, Analytical biochemistry, 2012, n°426, p. 109-117
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269712002266