La chromatograhie liquide à phase stationnaire : futur substitut aux techniques in vitro ?

 

La chromatographie en phase liquide peut remplacer avantageusement les études in vitro utilisées de manière prédictive pour diminuer le nombre d’études in vivo et limiter l’utilisation d’animaux de laboratoire.

Les techniques in vitro mettent en œuvre des supports biologiques généralement précieux et coûteux tels que des anticorps, des enzymes ou des cellules.
En permettant des études de lipophilie, de transport de substances exogènes dans l’organisme ainsi que des études d’interaction de ces substances au niveau des membranes cellulaires, la chromatographie peut donc être une approche intéréssante.
T. Geetha et S. Singh proposent une revue de travaux qui ont été menés en utilisant des colonnes de chromatographie greffées avec des modèles de membranes biologiques. Ce concept est appelé IAMs soit Immobilized Artificial Membranes. Il consiste à greffer sur des colonnes de type silice des groupements mimant la cible biologique à étudier.

 

 

Les membranes des cellules de l’organisme sont composées principalement de phospholipides. Elles sont donc hydrophobes. En recherche pré-clinique, il est primordial d’étudier la lipophilie des molécules afin de prédire si elles pourront passer les barrières cellulaires et ainsi pouvoir atteindre leur cible. Un des paramètres couramment déterminé pour évaluer l’hydrophobicité d’une molécule est le logP (détermination basée sur un partage de la molécule entre une phase aqueuse et une phase organique : l’octanol). Des études ont démontré une bonne corrélation (r = 0,976) entre la détermination de la lipophilie par la technique du logP et celle utilisant des colonnes chromatographiques avec une phase stationnaire composée d’une monocouche de phospholipides. En présentant les avantages d’être simple, rapide et reproductible, la technique chromatographique semble mieux adaptée à la détermination de la lipophilie.  

Ces colonnes greffées avec des phospholipides permettent également de prédire le transport de molécules à travers les membranes cellulaires. Le modèle in vitro le plus couramment utilisé étant les cellules Caco-2 (culture de lignée cellulaires de l’intestin humain). La corrélation entre la chromatographie et cette technique in vitro de référence est de 0,854. En étant plus rapide, plus simple et beaucoup moins coûteuse, la chromatographie semble être une bonne alternative. 

Les colonnes chromatographiques peuvent être greffées avec d’autres composés que des phospholipides afin d’apporter de nombreuses informations au-delà du caractère lipophile de molécules.

On peut citer parmi ces applications les travaux de Turowski et Kaliszan qui ont greffé des protéines de kératine sur la silice afin de prédire la perméabilité de la peau à des molécules exogènes. Les colonnes permettent donc ici de remplacer les coûteuses études in vitro utilisant des peaux mortes ou des peaux reconstituées.

Une autre application de ce concept consiste en l’utilisation de colonnes dites HSA (Human Serum Albumine) où la protéine d’albumine sert de phase stationnaire. L’albumine étant le transporteur sérique des molécules exogènes le plus couramment étudié, cette technique permet de prédire quelle sera la fraction liée et la fraction libre de la molécule. Etant donné que seule la fraction libre pourra agir sur la cible, cette détermination sera un bon indicateur aux futures études de biodisponibilité qui seront menées in vivo.

Les travaux de Alebic-Kolbah et al. montrent que des colonnes greffées avec des microsomes de rat (fragments de membranes riche en enzyme de type cytochrome, enzymes jouant un rôle majeur dans la métabolisation des médicaments) ont pu être utilisées tels de véritables réacteurs enzymatiques en catalysant des réactions produisant des glucuronides.

En conclusion, la diversification des phases stationnaires des colonnes de chromatographie offrent de multiples opportunités. En support des études in vitro, elles permettent de prédire quelle pourra être l’absorption des molécules une fois administrées. En étant simples à mettre en œuvre, rapides, reproductives et moins coûteuses, elles viennent en support des techniques usuelles in vitro. Afin d’étendre l’utilisation de la chromatographie, les fabricants de colonnes vont devoir diersifier leur offre concernant les phases stationnaires commercialisées. Les textes règlementaires vont également devoir évoluer en proposant ces techniques comme alternative aux techniques in vitro actuellement décrites. 

 

Source : Thiraviyam Geetha and Saranjit Singh, Applications of immobilized stationary-phase liquid chromatography : a potential in vitro technique, PSTT, vol. 3, december 2000, n°3, p. 406-416.

http://cat.inist.fr/?amodele=affichen&cpsidt=850180

 

 

 

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