Les colonnes HPLC à noyaux durs peuvent-elles vraiment rivaliser avec les performances de l’UHPLC ?

En première intention, nous utilisons systématiquement l’UHPLC pour développer les méthodes de séparation en chromatographie liquide. Cependant, nous sommes régulièrement obligés de transférer ces méthodes en conditions HPLC pour les adapter à l’équipement disponible chez nos clients. A cette occasion, le choix de la colonne et les performances associées alimentent les discussions techniques et aboutissent immanquablement à la questions suivante:
Jusqu’où les colonnes modernes (noyaux durs en particulier) utilisables à moins de 450-500bars peuvent rivaliser avec les performances de l’UHPLC ?
Pour apporter des éléments de réponse, nous avons comparé 8 colonnes (1 UHPLC et 7 HPLC) lors de la mise au point d’une méthode d’analyse de 2 principes actifs pharmaceutiques et de leurs 4 impuretés. Ils nous a semblé intéressant d’analyser ces résultats hors du contexte de l’étude afin d’apporter des éléments comparatifs entre les différentes colonnes testées.

Description des 8 colonnes

photo tableau

La méthode développée a été déclinée sur chaque colonne en tenant compte des paramètres géométriques. La quantité injectée, la programmation du gradient et le débit ont donc été adaptés.

chromatoPour évaluer la performance de chaque colonne, nous avons retenu   4 critères : la moyenne des 6 facteurs de symétrie, la moyenne des largeurs à la base des 6 pics, la moyenne des 5 résolutions et la moyenne des 6 nombres de plateaux théoriques par unité de longueur. Nous avons ensuite utilisé une fonction de désirabilité (Derringer et Suich) pour trouver le meilleur compromis sur ces 4 paramètres.

tableau desirab

Dans notre cas nous avons choisi pour chaque critère une fonction linéaire variant entre les bornes 0 (valeur la plus petite de la collection pour le critère considéré) et 1 (valeur la plus grande de la collection pour le critère considéré).

graph

 

On obtient ainsi pour chaque colonne 4 valeurs de désirabilité correspondant aux 4 critères retenus.

 

 

desirabilite

Le score d’une colonne est obtenu en calculant la désirabilité globale comme la moyenne géométrique des désirabilités individuelles de chaque critère pour la colonne considérée.

graph global

Les valeurs des désirabilités des quatre critères étudiés sont homogènes sur les 5 premières colonnes. Cette homogénéité n’est plus observée sur les trois autres colonnes dont la désirabilité globale est inférieure à 0,5. On peut noter une très bonne performance des colonnes à noyau dur. Les trois colonnes de trois marques différentes ont des résultats très proches avec des désirabilités globales supérieures à 0,8 et comparables à celle obtenue sur la colonne UHPLC (Acquity CSH C18).

Ces résultats ont été obtenus pour une méthode d’analyse et une série de composés particuliers, il serait donc hasardeux de trop généraliser ces conclusions. Néanmoins cet exemple montre que les colonnes à noyau dur peuvent être une alternative aux méthodes UHPLC pour les laboratoires qui ne possèdent pas l’équipement et qui n’ont pas de contraintes fortes sur la durée d’analyse.

 

 

Elaboration et optimisation de méthodes chromatographiques: DryLab® vs Fusion AE™ LC Method Development (2)

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Dans la série de nos papiers sur les logiciels d’optimisation en chromatographie liquide, un article* très intéressant de l’équipe du Dr Molnár à paraître dans la revue LC-GC, nous permet de comparer deux des principaux logiciels disponibles : DryLab® et Fusion AE™ LC Method Development.

s-matrix-logo

L’avènement des principes de « Quality by Design » (QbD) et la généralisation de la sous-traitance ont fait émerger de nouvelles problématiques dans le monde de la chromatographie. Elles peuvent se résumer en deux points : la prédiction de paramètres critiques (QbD) et la robustesse des méthodes d’analyse en vue de leurs transferts inter-laboratoires. Une des possibilités pour répondre à ces problématiques est d’utiliser des logiciels de modélisation. Il est donc utile d’identifier les deux familles de logiciels qui se partagent le marché.

On peut en effet distinguer d’une part les logiciels d’optimisation de méthodes et de modélisation qui s’appuient sur les lois théoriques chromatographiques (à titre d’exemple, on peut citer le logiciel DryLab®, développé par l’institut Molnár) et, d’autre part, des logiciels de plans d’expériences.

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Fusion AE™ LC Method Development : élaboration et optimisation de méthodes chromatographiques (1)

s matrix logoFusion AE™ LC Method Development est un logiciel que nous utilisons systématiquement pour le développement de méthodes d’analyse par plan d’expériences (en HPLC/UHPLC et SFC notamment). Nous vous proposons ici une introduction à ce logiciel en préambule à une série d’articles concernant son utilisation.

Fusion AE™ LC Method Development, développé par S-Matrix®, est un logiciel qui permet l’utilisation des plans d’expériences pour le criblage des paramètres dans l’élaboration et l’optimisation de méthodes d’analyse chromatographique. Sa particularité et son intérêt résident dans la possibilité d’automatiser entièrement la démarche : de la construction du plan à l’analyse des données. Il n’est pas nécessaire d’avoir des connaissances préalables ni des plans d’expériences ni des méthodes statistiques. Sauf erreur de ma part, il est sur ce point sans concurrent.

image blogEn effet, en plus de l’aspect calculatoire et purement mathématique, S-Matrix ® a développé une interface chromatographique d’une simplicité et d’une efficacité redoutable. Un mode automatique prend en charge tous les choix mathématiques et statistiques (type de plan d’expériences, modèle mathématique…) qui pourraient dérouter l’utilisateur non averti. Quant à l’analyse des rapports, Fusion AE™ propose des outils graphiques pour évaluer rapidement l’influence des différents paramètres sur la réponse étudiée.

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Colonnes Core-shell: une offre pléthorique ! (3)

Depuis la parution de notre post du 08-août-2013, un certain nombre de nouveautés sont venues  grossir les rangs des colonnes Core-shell ou noyaux durs que l’on peut trouver chez de nombreux fournisseurs. Pour essayer d’y voir un peu plus clair sur l’ensemble de l’offre et faciliter les comparaisons, nous avons mis à jour le recensement des fournisseurs, noms commerciaux, granulométries, types de phase et dimensions.Fabriquants

Après l’entrée de Waters dans le monde des colonnes à noyaux durs avec ses colonnes Cortecs™, et l’élargissement de la gamme Kinetex™ de Phenomenex, c’est au tour de Perkin Elmer d’entrer dans la danse avec sa gamme de colonne Brownlee SPP™ de 2.7µm (avec des greffages courants C8, C18, ES-C18) dans laquelle on relève trois dimensions originales: une C8 et une C18 de 4.6 x 20 mm et une C18 de 3 x 20mm. Les Brownlee SPP™ comprennent également des greffages plus  particuliers comme les HILIC, PFP, Phenyl-Hexyl et RP-Amide. Pour ces derniers, pas de plus par rapport aux colonnes des autres fournisseurs.

Chez Interchim, la gamme Halo™ s’agrandit, elle propose désormais pour les 2.7µm des ES-18 de diamètre 2.1, 3 et 4.6 mm de 20 à 250 mm de longueur. Elle rejoint également les Ascentis™  (Supelco-Sigma Aldrich) pour les colonnes ES-Cyano en proposant en plus une longueur de 250 mm. On remarque également des colonnes de granulométries un peu atypiques 3.4 et 4.7µm.

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Nouvelles colonnes échangeuses d’anions 4 µm

Thermo Scientific étend sa gamme de colonnes pour l’analyse des oligonucléotides. Il s’agit des colonnes DNAPac PA200 RS. Disponibles en 3 dimensions (50 x 4.6 mm, 150 x 4.6 mm et 250 x 4.6 mm), ces colonnes bénéficient d’une technologie à faible diamètre de particules (4 µm) et à forte résistance mécanique (elles peuvent supporter des pressions allant jusqu’à 750 bars/11 000 psi). Ces phases échangeuses d’anions utilisent la même chimie que les DNAPac PA200 existantes dont les particules ont un diamètre de 8 µm.

De manière tout à fait attendue, plusieurs exemples présentés mettent en évidence un gain d’efficacité sur la colonne RS (4 µm) par rapport à l’ancien support (8 µm) en particulier sur les oligonucléotides.

Par contre, le gain de résolution évoqué, n’est pas très évident sur les chromatogrammes présentés, notamment sur la séparation de 7 anions où la concentration injectée semble plus importante sur la colonne 8 µm ce qui, bien sur, peut dégrader la résolution observée.

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En effet, le transfert à une colonne de plus faible diamètre de particule se traduit généralement par une augmentation de la hauteur de pic et une diminution de la largeur pour une même concentration injectée (à condition que la colonne ai une capacité suffisante).

L’intérêt majeur de ces colonnes échangeuses d’anions réside dans leur résistance à la pression (750 b) ce qui ouvre le champ d’utilisation aux systèmes UHPLC.

Source : J.R. Thayer et al., Performance Improvements for High Resolution Anion-Exchange Oligonucleotide Separations Using Small Particle Substrates, Thermo Scientific Poster Note-PN70515_E01/13S