Apport de l’UHPLC dans l’étude des protéines hydro-solubles du blé

  

Le blé est composé principalement de deux types de protéines : les protéines de stockage et les protéines dites métaboliques. Ces dernières incluent des protéines hydro-solubles souvent impliquées dans des réactions allergiques (notamment l’asthme du boulanger). La répartition de ces protéines dans le grain de blé est complexe et variable. Il est donc primordial de disposer d’une méthode d’analyse séparatrice résolutive, reproductible, facilement automatisable et d’un coût le plus faible possible.

L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide est la technique traditionnellement utilisée pour la séparation des protéines du grain de blé. Mais cette technique présente une faible efficacité et une faible reproductibilité. L’utilisation de l’électrophorèse capillaire et de l’HPLC ont permis d’améliorer la séparation des protéines et d’augmenter la rapidité des analyses en permettant une automatisation. L’équipe de Z. Yu a cherché à optimiser encore ces analyses en développant une méthode par UHPLC. En utilisant des colonnes de faible granulométrie (1,7µm), ils ont pu obtenir une efficacité allant de 100 000 à 300 000 plateaux théoriques par mètre pour les protéines du blé.

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Colonnes sub 2 µm: poreuse ou core-shell ! (suite)

  

Comme suite à l’article du 13 juin 2012 dans lequel nous avions présenté les résultats de la comparaison d’une colonne core-shell Kinetex™ PFP 100 x 2.1 mm 1.7 µm (Phenomenex), et d’une colonne poreuse Acquity™ PFP 100 x 2.1 mm 1.8 µm (Waters) pour l’analyse UHPLC d’un échantillon d’oligosaccharide thérapeutique (C95H143N11O59S8Na8 – Mw = 2823 g/mol), nous avons étendu le test à 3 autres colonnes poreuses:

- Pinnacle™ PFP Propyl 100 x 2.1 mm 1.7 µm (Restek)
- Hypersil Gold™ PFP 100 x 2.1 mm 1.9 µm (Thermo)
- ACE Excel 2™ C18-PFP 100 x 2.1 mm 2.0 µm (AIT)

Les conditions d’analyses sont identiques pour toutes les colonnes, détection UV 244 nm, gradient d‘élution Méthanol/Tampon de 10 min.

HPLC: Détermination du volume mort de la colonne

  

Comme suite à notre article du 11 juin dernier «  HPLC: Rétention d’un composé au volume mort  » et pour répondre à la suggestion de Mikaël, nous soumettons quelques éléments pour la détermination du volume mort.

La connaissance de la géométrie de la colonne et des caractéristiques physiques de la phase stationnaire ne suffisent pas pour évaluer correctement le volume occupé par la phase mobile.
En effet, en chromatographie liquide en phase inversée avec des phases silice gréffée n-alkyl, le volume mort (V0)  de la colonne est théoriquement indéterminé en raison de l’adsorption du modificateur organique sur les chaînes n-alkyle et de l’eau sur les groupes silanols.
Avec des phases mobiles binaires (eau/méthanol ou eau/acétonitrile) les phénomènes sont trés complexes et peuvent entainer des variations trés importantes de V0 selon la nature et la composition de la phase mobile.

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Les colonnes core-shell utilisées en chromatographie à Fluide Supercritique

 

L’efficacité en chromatographique liquide a été spectaculairement améliorée par l’introduction des particules de diamètre inférieur à 2 micron utilisées en UHPLC et par le développement récent des particules à noyau dur superficiellement poreuses (core-shell).
Un article d’ E. Lesellier paru dans Journal of chromatography  décrit l’association de ces dernières générations de colonnes avec la chromatographie à fluide supercritique qui
permet d’accroitre encore l’efficacité de sépartion.
En effet les phases mobiles constituées de fluides à l’état supercritique ont des viscosités très inférieures aux phases mobiles liquides utilisées HPLC ou UHPLC. Elle conduisent à une meilleure efficacité théorique avec des baisses significatives de la pression. Il est donc possible d’utiliser des débits unitaires beaucoup plus élevés ou des colonnes beaucoup plus longues.
Le comportement cinétique des colonnes à noyau dur a été étudié en fonction du débit, de la pression et de la température, sur l’analyse d’une série d’alkylbenzènes avec 10% de méthanol ou d’acétonitrile dans le CO2. Les résultats ont été comparés aux particules entièrement poreuses classiques.

Une efficacité supérieure a été obtenue avec les nouvelles particules à noyau dur ce qui montre leur grand intérêt pour la chromatographie en fluide supercritique.
Cependant, des comportements cinétiques étonnants, qui favorisent l’efficacité des composés les plus retenus, sont observés. Ces comportements semblent dépendre du temps de séjour des composés dans la colonne, c’est à dire du débit de la phase mobile, et pourraient être expliqués par un gradient de température radial dans la colonne.

Source : E. Lesellier . Efficiency in supercritical fluid chromatography with different superficially porous and fully porous particles ODS bonded phases. Journal of Chromatography A,1228 (2012) 89-98

Analyse de Protéines natives sur colonne Core-shell

 

Thermo Fisher Scientific (AN 20506 – Joanna Freeke – Vleria Barattini) nous livre une note d’application sur l’utilisation d’une colonne core-shell, Accucore 150-C4-150Å, pour l’analyse d’un mélange de 6 protéines à l’état natif (sans digestion enzymatique).

 

Dans des conditions compatibles avec l’utilisation HPLC (185 bars) on obtient des pics symétriques, bien résolus. La dispersion des temps de rétention pour n=6 est également documentée. La capacité de pic, évaluée à 70 environ, reste  constante sur  l’étendue testée (de 30 à 1200 pmoles injectées). 

 

 

 

 

 

 

 

 

Alors qu’à cette granulométrie (2.6 µm) le standard du marché des Core-shell est plutôt à une porosité de 100Å, on peut citer la colonne Ascentis® Express Peptide ES-C18 HPLC (Supelco) qui présente une prorosité de 160Å.
Les colonnes Aeris® Wide Pore (Phenomenex) 200Å ou Poroschell®300 (Agilent) sont à 300Å mais pour des granulométries plus élevées (respectivement 3.6 et 5 µm).

On peut imaginer qu’un support 2-3µm avec une porosité de 300Å permettrait d’élargir les possibilités sur ce type d’applications.