Fusion AE™ LC Method Development : élaboration et optimisation de méthodes chromatographiques (1)

s matrix logoFusion AE™ LC Method Development est un logiciel que nous utilisons systématiquement pour le développement de méthodes d’analyse par plan d’expériences (en HPLC/UHPLC et SFC notamment). Nous vous proposons ici une introduction à ce logiciel en préambule à une série d’articles concernant son utilisation.

Fusion AE™ LC Method Development, développé par S-Matrix®, est un logiciel qui permet l’utilisation des plans d’expériences pour le criblage des paramètres dans l’élaboration et l’optimisation de méthodes d’analyse chromatographique. Sa particularité et son intérêt résident dans la possibilité d’automatiser entièrement la démarche : de la construction du plan à l’analyse des données. Il n’est pas nécessaire d’avoir des connaissances préalables ni des plans d’expériences ni des méthodes statistiques. Sauf erreur de ma part, il est sur ce point sans concurrent.

image blogEn effet, en plus de l’aspect calculatoire et purement mathématique, S-Matrix ® a développé une interface chromatographique d’une simplicité et d’une efficacité redoutable. Un mode automatique prend en charge tous les choix mathématiques et statistiques (type de plan d’expériences, modèle mathématique…) qui pourraient dérouter l’utilisateur non averti. Quant à l’analyse des rapports, Fusion AE™ propose des outils graphiques pour évaluer rapidement l’influence des différents paramètres sur la réponse étudiée.

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En SFC : Colonnes poreuses ou noyau dur ?

De la même manière que nous nous étions intéressés à cette comparaison en UHPLC, nous présentons ici des résultats d’analyse de 4 acides gras saturés par SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry) obtenus sur cinq colonnes.

Le mélange d’acides gras est composé des acides laurique C12:0, myristique C14:0, palmitique C16:0 et stéarique C18:0.
Les colonnes testées sont indifféremment utilisables en chromatographie liquide ou supercritique:

  • Colonnes à particules poreuses
    Aquity HSS C18 100 x 3 mm – 1,8 µm (Waters)
    ACE Excel 2 super C18 100 x 3 mm – 2 µm (AIT)
    XBridge 100 x 3 mm – 3,5 µm (Waters)
  • Colonnes à noyaux durs
    Kinetex C18 100 x 3 mm – 2,6 µm (Phenomenex)
    Nucleoshell RP18 100 x 3 mm – 2,7 µm (Macherey-Nagel)

Nous avons utilisé un système chromatographique UPC2™ (Waters) couplé à une détection masse (quadripôle avec source electro-spray). Pour chaque colonne, le débit et le gradient ont été adaptés à la granulométrie pour maintenir les conditions optimales de vitesse linéaire de la phase mobile.

chromatos

tableau

Comme attendu, les performances des colonnes poreuses s’améliorent avec la diminution de la granulométrie.
Par contre, il est plus étonnant  de constater que l’efficacité des 2 colonnes noyaux durs testées reste en deçà de celle des poreuses sub 2 µm et simplement comparable à celle d’une phase poreuse 3.5 µm (XBridge).

Nous n’avions pas observé cela jusqu’à présent en UHPLC. Le coefficient de diffusivité élevé du COà l’état supercritique est un des facteurs majeur expliquant les performances des colonnes sub 2µm dans cette expérience, il favorise le processus de transfert de masse entre les deux phases et a donc tendance à niveler cet avantage connu des colonnes core-shell.

Intérêt de la SFC pour l’analyse de composés aromatiques halogénés

Nous avons évalué l’intérêt d’une méthode SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry) pour la recherche de composés aromatiques halogénés, impuretés d’un intermédiaire de synthèse d’un principe actif pharmaceutique.

La SFC est une technique de séparation chromatographique où la phase mobile est un fluide porté à l’état supercritique ou subcritique. On utilise couramment le CO2 car son point critique est facilement accessible (31,0°C et 73,8 bars). La phase stationnaire, contenue dans une colonne, peut être constituée de particules solides de granulométrie fine (silice ou graphite poreux par exemple), ou être chimiquement modifiée comme les phases utilisées en chromatographie liquide.

Nous avons développé une méthode sur un système UPC2™ (Waters) couplé à une détection masse (quadripole avec source electrospray).
4 facteurs ont été étudiés : la nature du co-solvant (acétonitrile, méthanol éthanol), le gradient de phase mobile (co-solvant/CO2), la température de colonne et la nature de la colonne (Éthyle pyridine, C18, silice, fluorophenyl) sur la base de trois plans d’expériences définit à partir du logiciel d’optimisation Fusion™ (S-Matrix®). Les réponses étudiées sont le nombre de pics, la résolutions des pics et le temps de rétention du dernier pic.
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Analyse d’acides gras par SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry)

Dans une note d’applicationpubliée en juillet 2013, Waters® a présenté des travaux sur le développement d’une méthode de dosage d’une série de corps gras par SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry).

La SFC est une technique de séparation chromatographique où la phase mobile est un fluide porté à l’état supercritique ou subcritique. On utilise couramment le CO2 car son point critique est facilement accessible (31,0°C et 73,8 bars). La phase stationnaire, contenue dans une colonne, peut être constituée de particules solides de granulométrie fine (silice ou graphite poreux par exemple), ou être chimiquement modifiée comme les phases utilisées en chromatographie liquide.

La mise en oeuvre de cette technique au laboratoire nous a permis d’obtenir la séparation rapide de 4 acides gras saturés (à titre d’exemple, nous avons choisi d’étudier l’acide laurique C12:0, l’acide myristique C14:0, l’acide palmitique C16:0 et l’acide stéarique C18:0) en s’affranchissant de l’étape de dérivatisation habituellement pratiquée en CPG (Chromatographie en Phase Gazeuse) pour l’analyse des acides gras.

Chromato

Nous retenons particulièrement de cette note l’utilisation d’un co-solvant acidifié (méthanol-acide formique 0.1%) qui permet d’utiliser un mécanisme de suppression d’ion (habituel en chromatographie liquide) et d’un make-up de méthanol alcalinisé (ammoniac ou acétate d’amonium dans notre cas) qui rend possible une détection en masse par un électrospray négatif.

La méthode présentée dans cette note d’application est donc aisément transposable dans un laboratoire disposant de l’UPC² couplé à un spectromètre de masse et pourrait être déclinée à d’autres composés ionisables.

1 : Fast and Simple Free Fatty Acids Analysis Using UPC²/MS, Giorgis Isaac et al., Application note, Waters Corporation, Manchester, UK.

Couplage SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry)

Dans la continuité des articles publiés précédemment sur des applications SFC, nous nous sommes intéressés au couplage SFC-MS. Nous présentons ici le transfert d’une méthode SFC-UV de dosage de filtres solaires (post du 2 juillet 2013) en SFC-MS

Les essais sont réalisés sur un système UPC² (Waters) couplé à un détecteur à barrettes de diode et à un spectromètre de masse simple quadripôle SQ-ESI/APCI (Waters).

SFCMS

Le couplage SFC-MS, bien que rendu très aisé par lintroduction du système UPC² , présente quelques spécificités comparativement à un couplage UHPLC-MS.
Il est en effet nécessaire d’introduire un solvant supplémentaire avant la source (typiquement  une solution d’acide formique diluée) qui a un double rôle:
- apporter la phase liquide nécessaire à la formation de l’électrospray,
- apporter un sel nécessaire à l’ionisation.

Par ailleurs, à l’arrivée dans la source du spectromètre de masse, le CO2 subit une décompression. Ce processus est endothermique, les températures de travail pour la source et la désolvatation doivent donc être suffisamment élevées pour compenser ce phénomène.

Pour le reste, les paramètres habituels spécifiques à la spectrométrie de masse tels que tension de capillaire, de cone, temps d’acquisition, vitesse de scan…ont été optimisés pour obtenir le chromatogramme dont le TIC (Total Ionic Current) est présenté ici.

Chromato TIC

D’autres applications en SFC-MS développées au laboratoire seront présentées prochainement.