Acquity UPC2 Torus : une nouvelle génération de colonnes pour la SFC

En 2012 Waters introduit le système UPC²™ et une gamme de colonnes dédiées à la chromatographie par fluide supercritique (SFC) : les colonnes Acquity UPC²™. Aujourd’hui une nouvelle génération de colonne voit le jour : les colonnes Acquity UPC² Torus™.

Silice BEHLes 4 colonnes historiques, toujours disponibles, sont les Acquity UPC² BEH, BEH-2-Ethylpyridine, HSS C18 SB (StableBond) et CSH Fluorophényl. Les particules BEH (Bridged Ethylene Hybrid) contiennent des ponts éthane qui forment avec la silice une phase hybride de polyethoxysilane. Les phases BEH et HSS (High Stenght Silica), dites de deuxième génération, sont présentées comme très robustes et résistantes à de très hautes pressions (jusqu’à 15000 psi). La silice CSH (Charged Surface Hybrid), assimilée à une troisième génération de la technologie de particules hybrides, est une BEH à laquelle ont été ajoutées des charges de surface. Il faut noter que ces trois bases de silice ainsi que les différents greffages (à l’exception de l’EP qui est unique à la gamme Acquity UPC²) sont disponibles sur des colonnes pour l’UHPLC et HPLC.

Les colonnes Acquity UPC² Torus (appelées par la suite Torus) sont quant à elles toutes composées d’une base de silice BEH modifiée par une première étape de greffage hydrophile (-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH) pour contrôler les caractéristiques de rétention et minimiser les interactions superficielles. Puis vient une seconde étape de greffage qui confère les propriétés de sélectivité. Les groupements disponibles [2-Picolylamine (Torus 2-PIC), Diéthylamine (Torus DEA), 1-Aminoanthracène (Torus 1-AA) et Diol (Torus Diol)] sont inédits et spécifiques à la gamme Torus, ils ne sont donc pas disponibles en UHPLC et HPLC.

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Les colonnes HPLC à noyaux durs peuvent-elles vraiment rivaliser avec les performances de l’UHPLC ?

En première intention, nous utilisons systématiquement l’UHPLC pour développer les méthodes de séparation en chromatographie liquide. Cependant, nous sommes régulièrement obligés de transférer ces méthodes en conditions HPLC pour les adapter à l’équipement disponible chez nos clients. A cette occasion, le choix de la colonne et les performances associées alimentent les discussions techniques et aboutissent immanquablement à la questions suivante:
Jusqu’où les colonnes modernes (noyaux durs en particulier) utilisables à moins de 450-500bars peuvent rivaliser avec les performances de l’UHPLC ?
Pour apporter des éléments de réponse, nous avons comparé 8 colonnes (1 UHPLC et 7 HPLC) lors de la mise au point d’une méthode d’analyse de 2 principes actifs pharmaceutiques et de leurs 4 impuretés. Ils nous a semblé intéressant d’analyser ces résultats hors du contexte de l’étude afin d’apporter des éléments comparatifs entre les différentes colonnes testées.

Description des 8 colonnes

photo tableau

La méthode développée a été déclinée sur chaque colonne en tenant compte des paramètres géométriques. La quantité injectée, la programmation du gradient et le débit ont donc été adaptés.

chromatoPour évaluer la performance de chaque colonne, nous avons retenu   4 critères : la moyenne des 6 facteurs de symétrie, la moyenne des largeurs à la base des 6 pics, la moyenne des 5 résolutions et la moyenne des 6 nombres de plateaux théoriques par unité de longueur. Nous avons ensuite utilisé une fonction de désirabilité (Derringer et Suich) pour trouver le meilleur compromis sur ces 4 paramètres.

tableau desirab

Dans notre cas nous avons choisi pour chaque critère une fonction linéaire variant entre les bornes 0 (valeur la plus petite de la collection pour le critère considéré) et 1 (valeur la plus grande de la collection pour le critère considéré).

graph

 

On obtient ainsi pour chaque colonne 4 valeurs de désirabilité correspondant aux 4 critères retenus.

 

 

desirabilite

Le score d’une colonne est obtenu en calculant la désirabilité globale comme la moyenne géométrique des désirabilités individuelles de chaque critère pour la colonne considérée.

graph global

Les valeurs des désirabilités des quatre critères étudiés sont homogènes sur les 5 premières colonnes. Cette homogénéité n’est plus observée sur les trois autres colonnes dont la désirabilité globale est inférieure à 0,5. On peut noter une très bonne performance des colonnes à noyau dur. Les trois colonnes de trois marques différentes ont des résultats très proches avec des désirabilités globales supérieures à 0,8 et comparables à celle obtenue sur la colonne UHPLC (Acquity CSH C18).

Ces résultats ont été obtenus pour une méthode d’analyse et une série de composés particuliers, il serait donc hasardeux de trop généraliser ces conclusions. Néanmoins cet exemple montre que les colonnes à noyau dur peuvent être une alternative aux méthodes UHPLC pour les laboratoires qui ne possèdent pas l’équipement et qui n’ont pas de contraintes fortes sur la durée d’analyse.

 

 

En SFC : Colonnes poreuses ou noyau dur ?

De la même manière que nous nous étions intéressés à cette comparaison en UHPLC, nous présentons ici des résultats d’analyse de 4 acides gras saturés par SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry) obtenus sur cinq colonnes.

Le mélange d’acides gras est composé des acides laurique C12:0, myristique C14:0, palmitique C16:0 et stéarique C18:0.
Les colonnes testées sont indifféremment utilisables en chromatographie liquide ou supercritique:

  • Colonnes à particules poreuses
    Aquity HSS C18 100 x 3 mm – 1,8 µm (Waters)
    ACE Excel 2 super C18 100 x 3 mm – 2 µm (AIT)
    XBridge 100 x 3 mm – 3,5 µm (Waters)
  • Colonnes à noyaux durs
    Kinetex C18 100 x 3 mm – 2,6 µm (Phenomenex)
    Nucleoshell RP18 100 x 3 mm – 2,7 µm (Macherey-Nagel)

Nous avons utilisé un système chromatographique UPC2™ (Waters) couplé à une détection masse (quadripôle avec source electro-spray). Pour chaque colonne, le débit et le gradient ont été adaptés à la granulométrie pour maintenir les conditions optimales de vitesse linéaire de la phase mobile.

chromatos

tableau

Comme attendu, les performances des colonnes poreuses s’améliorent avec la diminution de la granulométrie.
Par contre, il est plus étonnant  de constater que l’efficacité des 2 colonnes noyaux durs testées reste en deçà de celle des poreuses sub 2 µm et simplement comparable à celle d’une phase poreuse 3.5 µm (XBridge).

Nous n’avions pas observé cela jusqu’à présent en UHPLC. Le coefficient de diffusivité élevé du COà l’état supercritique est un des facteurs majeur expliquant les performances des colonnes sub 2µm dans cette expérience, il favorise le processus de transfert de masse entre les deux phases et a donc tendance à niveler cet avantage connu des colonnes core-shell.

Intérêt de la SFC pour l’analyse de composés aromatiques halogénés

Nous avons évalué l’intérêt d’une méthode SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry) pour la recherche de composés aromatiques halogénés, impuretés d’un intermédiaire de synthèse d’un principe actif pharmaceutique.

La SFC est une technique de séparation chromatographique où la phase mobile est un fluide porté à l’état supercritique ou subcritique. On utilise couramment le CO2 car son point critique est facilement accessible (31,0°C et 73,8 bars). La phase stationnaire, contenue dans une colonne, peut être constituée de particules solides de granulométrie fine (silice ou graphite poreux par exemple), ou être chimiquement modifiée comme les phases utilisées en chromatographie liquide.

Nous avons développé une méthode sur un système UPC2™ (Waters) couplé à une détection masse (quadripole avec source electrospray).
4 facteurs ont été étudiés : la nature du co-solvant (acétonitrile, méthanol éthanol), le gradient de phase mobile (co-solvant/CO2), la température de colonne et la nature de la colonne (Éthyle pyridine, C18, silice, fluorophenyl) sur la base de trois plans d’expériences définit à partir du logiciel d’optimisation Fusion™ (S-Matrix®). Les réponses étudiées sont le nombre de pics, la résolutions des pics et le temps de rétention du dernier pic.
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Analyse d’acides gras par SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry)

Dans une note d’applicationpubliée en juillet 2013, Waters® a présenté des travaux sur le développement d’une méthode de dosage d’une série de corps gras par SFC-MS (Supercritical Fluid Chromatography Mass Spectrometry).

La SFC est une technique de séparation chromatographique où la phase mobile est un fluide porté à l’état supercritique ou subcritique. On utilise couramment le CO2 car son point critique est facilement accessible (31,0°C et 73,8 bars). La phase stationnaire, contenue dans une colonne, peut être constituée de particules solides de granulométrie fine (silice ou graphite poreux par exemple), ou être chimiquement modifiée comme les phases utilisées en chromatographie liquide.

La mise en oeuvre de cette technique au laboratoire nous a permis d’obtenir la séparation rapide de 4 acides gras saturés (à titre d’exemple, nous avons choisi d’étudier l’acide laurique C12:0, l’acide myristique C14:0, l’acide palmitique C16:0 et l’acide stéarique C18:0) en s’affranchissant de l’étape de dérivatisation habituellement pratiquée en CPG (Chromatographie en Phase Gazeuse) pour l’analyse des acides gras.

Chromato

Nous retenons particulièrement de cette note l’utilisation d’un co-solvant acidifié (méthanol-acide formique 0.1%) qui permet d’utiliser un mécanisme de suppression d’ion (habituel en chromatographie liquide) et d’un make-up de méthanol alcalinisé (ammoniac ou acétate d’amonium dans notre cas) qui rend possible une détection en masse par un électrospray négatif.

La méthode présentée dans cette note d’application est donc aisément transposable dans un laboratoire disposant de l’UPC² couplé à un spectromètre de masse et pourrait être déclinée à d’autres composés ionisables.

1 : Fast and Simple Free Fatty Acids Analysis Using UPC²/MS, Giorgis Isaac et al., Application note, Waters Corporation, Manchester, UK.